Computadores bacterianos

De acordo com o verbete do wikipedia, um computador é uma máquina programável desenhada para, automaticamente, realizar um sequência de operações aritiméticas ou lógicas. Um computador pode prover-se de inúmeros atributos, dentre eles armazenamento de dados, processamento de dados, cálculo em grande escala, desenho industrial, tratamento de imagens gráficas, realidade virtual, entretenimento e cultura.

Os primeiros computadores analógicos surgiram no século XVII e eram capazes de realizar as funções básicas de somar, subtrair, multiplicar e dividir. Mas foi na II Guerra Mundial, em meados do século XX, que realmente nasceram os computadores atuais. A Marinha dos Estados Unidos, em conjunto com a Universidade de Harvard, desenvolveu o computador Harvard Mark I, projetado pelo professor Howard Aiken, com base no calculador analítico de Babbage. O Mark I ocupava 167m2 e pesada cerca de 30 tonelada aproximadamente, conseguindo multiplicar dois números de dez dígitos em três segundos.Seu funcionamente era parecido com uma calculadora simples de hoje em dia. Nem é preciso falar o quanto esta tecnologia se desenolveu até hoje, em que hoje se discuti processadores quânticos e se faz computação em nuvem.

Uma plataforma diferente das “baseadas no silício”, que estamos acostumados, são os biocomputadores. Em 1994, em um experimento muito elegante, Leonard Adleman desenvolveu o primeiro experimento envolvendo um computador de DNA para resolver o problema do Caminho Hamiltoniano: um problema que envolve caminhos hamiltonianos é o problema do caixeiro viajante, em que um caixeiro deseja visitar um conjunto de N cidades (vértices), passando por cada cidade exatamente uma vez, fazendo o caminho de menor tamanho possível (Figura 1).

 

Figura 1. O grafo em vermelho é hamiltoniano. Cada bola é um nó e cada flecha é uma aresta.

Existem multiplas possibilidades de construir um computador baseado em DNA, em que cada um possui suas vantagens e desvantagens. A maioria deles funciona utilizando as portas lógicas (AND, OR, NOT) associadas a lógica digital utilizando como base o DNA, como por exemplo,  o contador bacteriano . Porém os primeiros computadores moleculares baseados em DNA, são reações in vitro utilizando, por exemplo, enzimas de restrição, ligases, e DNA (Benenson et al. 2001). Através da mistura desse componentes e reações em cascada de digestão, ligação e hibridização, o output final é uma molécula detectável que representa o resultado computacional.

Em 1994, Leonard Aldleman foi capaz desenvolver um computador in vitro baseado em DNA para solucionar o problema  do Caminho Hamiltoniano (Figura 1), porém apenas em 2009, Baumgardner e colaboradores conseguiram resolver um problema complexo in vivo, em E. coli. Porém, para entender, é necessário uma série de abstrações para tornar sequências de DNA em vértices e arestas de um caminho hamiltoniano (ver Figura 2). A primeira abstração trata segmentos de DNA como as arestas de um determinado grafo. As arestas de DNA são flanqueados por sítios hixC que podem ser embaralhados por um recombinase Hin, criando diversas ordens e orientações randômicas para as arestas do grafo. A segunda abstração está relacionada com os nós, com exceção do nó terminal, em que um nó é um gene divido ao meio por uma sequência hixC. Os autores conseguiram construir enzimas funcionais portando essas sequências codificadas no DNA. Dessa maneira, a primeira metade (5´) de um nó é encontrada na aresta de DNA que termina em um nó, enquanto a segunda metade (3´) do gene é encontrado em uma aresta de DNA que se origina no nó. Calma, realmente não é fácil entender, é preciso pensar e abstrair, veja a figura 2.

 

 Figura 2. Construção de DNA que codificam um problema do Caminho Hamiltoniano com três nós. a. O grafo contendo o caminho Hamiltoniando começa no nó RFP, procedendo para o nó GFP e terminando no nó TT. b. Construção ABC representam a solução para o problema dos três nós. Os três fragmentos de DNA flanqueado por hixC estão na ordem e orientação corretas, de maneira que os genes GFP e RFP estão intactos. ACB possui o gene RFP intacto, porém o gene GFP está errado, por fim, a construção BAC não possue nenhum gene intacto.

 A Figura 2a mostra o grafo com os 3 nós e as 3 arestas que foram escolhidas para serem codificados no computador bacteriano. O gráfico contêm um único caminho hamiltoniano que começa no nó RFP, viajando pela aresta A até o nó GFP, e utilizando a aresta B até alcançar o nó final TT. A aresta C, the RFP até TT é um detrator. A Figura 2b ilustra como as construções de DNA foram utilizadas para solucionar o problema do Caminho Hamiltoniano com um controle positivo e duas configurações sem soluções. Já que as soluções precisam originar no nó RFP e terminar no nó GFP, a aresta A de DNA contêm na extremidade 3´a metade de RFP seguida por a extremidade 5´de GFP. A aresta B de DNA se origina em GFP e termina em TT, dessa maneira, esse fragmento de DNA possui 3´GFP seguido de um terminado de transcrição duplo. A aresta C se origina em uma metade 3´ de RFP e termina em TT. Finalmente, com os genes codificadores para RFP e GFP estão intactos, com promotores e RBS, e seguintes de um terminador de transcripção, colônias ABC expressam fluorescência vermelha e verde, dessa maneira, possuem aparência amarela.

A programação de bacteria para computar soluções de problemas complexos podem oferecer as mesmas vantagens dos computadores atuais que estamos acostumados, porém, com as seguintes características adicionais: (i) sistemas bacterianos são autônomos, eliminando a necessidade de intervenção humana, (ii) computadores bacterianos podem se adaptar a condições flutuantes, evoluindo para resolver desafios de determinados problemas e (iii) o crescimento exponencial de bactérias continuamente aumente o número de processadores trabalhando em um problema (Baumgardner et al., 2009).

 Sem contar que eles ainda poderiam fazer fotossíntese…

 Adleman LM: Molecular computation of solutions to combinatorial problems. Science 1994, 266:1021-1024.

Benenson Y, Paz-Elizur T, Adar R, Keinan E, Livneh Z, Shapiro E: Programmable and autonomous computing machine made of biomolecules. Nature 2001, 414:430-434.

Baumgardner , J et al.  Solving a Hamiltonian Path Problem with a bacterial computer. J. Biol. Eng. 2009, 24;3:11.

O que é Biologia Sintética?

Este post deveria ser um dos primeiros artigos para um site que se diz especializado em biologia sintética. Mas confesso para vocês que definir o que é biologia sintética, para mim, não foi (é) uma tarefa fácil. Como podem ser vistos nos posts no blog, existem vários aspectos da synbio que permitem diferentes definições de acordo com o ponto de vista de quem está fazendo biologia sintética. Por exemplo, um engenheiro interessado em criar dispositivos computacionais sintéticos em uma bactéria, ou um biotecnólogo interessado em produzir biocombustíveis ou um biólogo querendo montar uma bactéria a partir de simples elementos químicos. Claramente, todas estas áreas estão conectadas, mas criar uma definição que consiga embarcar todas as possibilidades não é trivial. Por isso, digo que este post é orgânico, que deve mudar à medida que o meu conhecimento sobre o assunto se aprofunda.

Uma característica que une todos os biológos sintéticos é a vontade de tornar o processo de engenharia de sistemas biológicos mais fácil e confiável. Dentro desse contexto, existem quatro diferentes níveis de atuação da biologia sintética:

(i) partes biológicas: sendo o DNA a linguagem de programação, as partes biológicas são uma sequência de dados (AGCTA…) que possuem funções determinadas. Por exemplo, uma sequência de DNA que faz a célula mudar a cor de verde para amarelo. Estas partes são descritas, catalogadas e respeitam determinado padrão físico de montagem (leia mais sobre os biobricks). Espera-se que com o tempo se possam descrever as características de inúmeras partes biológicas para serem utilizadas para a construção de dispositivos, sistemas,…. Essa é uma das funções da Secretária de Partes Biológicas Padrão do MIT.

(ii) dispositivos sintéticos: são compostos por partes biológicas capazes de processar sinais. Processam inputs em outputs. Para a construção de dispositivos robustos e eficientes são necessárias partes que funcionem de uma maneira previsível. Veja mais sobre dispositivos sintéticos.

(iii) sistemas sintéticos: são um conjunto dispositivos capazes de captar sinais, processar informações e realizar funções determinadas, como por exemplo, uma célula capaz de captar algum sinal do ambiente e decidir se irá realizar uma determinada função como combater uma célula tumoral, produzir determinado metabólito etc.

(iv) por útimo, existe a arquitetura sintética de populações em que, por ex, cada microrganismo possui um dispositivo diferente, sendo necessário que estes dispositivos trabalhem em conjunto para realizar determinada função. Trabalhar em conjunto, como uma população que precisa trabalhar com sincronismo, é o caso dos osciladores. Para isso, é necessário dominar mecanismos robustos de comunicação célula-célula.

A biologia sintética pode ser aplicada em praticamente todas áreas da biologia molecular, biotecnologia e engenharia genética. Porém existem algumas áreas que se destacam como sendo próprias da biologia sintética:

1. Construção de uma célula mínima: identificação das partes básicas para construção de uma célula.

2.  Reconstrução de células: tendo como objetivo central a construção de formas de vida artificiais a partir de elementos químicos.

3. Construção de novos códigos genéticos.

5. Construção de células capazes de realizar funções diferentes daquelas encontradas na natureza, como a obtenção de novas rotas bioquímicas de produção de novos compostos. .

Essa última, talvez seja a que mais tenha impacto nas nossas vidas cotidianas a curto-prazo, através do desenvolvimento de remédios mais baratos e com a produção de combustíveis e químicos utilizando recursos renováveis.

Problemas com PCR!

Após desenhar o seu primer,  montar a sua reação e programar o termociclador, você pode enfrentar problemas para otimizar as sua condições de PCR. Algumas simples ações podem resultar em um produto de PCR específico. Estas são as questões mais comuns aqui no laboratório:

1. Estou tendo (muitos) fragmentos inespecíficos maiores do que o esperado. O que fazer?

- Diminuir o tempo de anelamento da reação;

- Aumentar a temperatura de anelamento (aumento 2 graus a cada teste);

- Diminuir o tempo de extensão;

- Colocar menos primers;

- Checar e colocar menos DNA;

2. Estou obtendo fragmentos inespecíficos menores do que o esperado. O que fazer?

- Aumentar a temperatura de anelamento;

- Aumentar o tempo de anelamento;

- Aumentar a temperatura de extensão;

- Aumentar a temperatura de extensão para 74-78 oC;

- Colocar menos primers e/ou menos DNA.

3. A reação estava funcionando antes, mas agora eu não obtenho nenhum produto.

- Tenha certeza que todos os componentes estão na reação (tampão, DNA, primers…);

- Teste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP (são sensíveis a descongelamentos consecutivos);

- Utilize um estoque novo de primers;

- Diminua sua temperatura de anelamento 6-10 oC, se não obtiver nenhum fragmento verifique todas os componentes.

Nos próximos posts vou comentar sobre técnicas de PCR: como RT-PCR, deleção de genes…

Como desenhar um primer? E como montar uma reação de PCR?

No post passado eu comentei sobre a técnica de PCR e de como programar um PCR. Neste post eu vou um pouco mais adiante e vou falar sobre como desenhar um iniciador (primer) e como montar uma reação de PCR.

O desenho do primer tem que ser feito com muito cuidado para garantir o futuro do projeto, erros no desenho podem ser percebidos apenas muito tempo depois, após muito esforço e dinheiro já ter sido gasto no projeto. Por isso, realize essa tarefa com muito cuidado, tendo em vista todo o projeto.

A primeira coisa é pegar a sequência de interesse no GenBank, como por exemplo para o gene codificador da enzima xilose isomerase de Escherichia coli. Conheça o gene, busque artigos sobre ele, veja os genes que estão envolta, como ele é regulado,… Depois salve a sequência do gene e mais ou menos 200 bp envolta dele em um documento word. Encontre o start códon, o stop códon, promotor,… e decida a sua estratégia de clonagem.

Para desenhar primers para amplificar o gene inteiro você precisará de regiões envolta do gene. Além disso existem uma série de regras a que você precisa ficar atento para desenhar o primer como: composição de G-C, tamanho do primer, temperatura de anelamento, formação de dímeros e estruturas secundárias e muito mais. Para este trabalho, eu recomendo utilizar um software, o FastPCR. Um software livre (gratuito) e amigável.

É preciso apenas colocar a sua sequência de interesse e pedir para que ele desenhe os primers, depois você precisa checar se aquela sequência amplifica a sua região de interesse. Para a encontrar o primer reverso na sua sequência tem uma ferramenta para obter o reverso complementar da sequência, já que as sequencias de primers são dadas no sentido 5´ – 3´.

Finalmente, você pode fazer um PCR in silico, para isso, volte para o Genbank e copie toda a sequência do genoma da bactéria desejada (isso pode demorar alguns minutos) e passe para o FastPCR para fazer o PCR in silico com os primers desenhados. Com isso, você pode verificar possíveis regiões amplificadas pelo seu par de primers.

Depois de mandar sintetizar os primers, você pode fazer um programa como mostrado no post anterior. Para a reação PCR você deve seguir o protocolo da sua Taq polimerase comprada. Vale a pena ressaltar que para amplificações de genes que serão expressos posteriormente, recomendo uma Taq polimerase de alta fidelidade.

No próximo post vou comentar sobre erros e soluções comuns que ocorrem com reações de PCR.

O que é um PCR? Como montar um programa de PCR?

Polymerase chain reaction ou reação da polimerase em cadeia (PCR) é técnica de biologia molecular utilizada para amplificar (aumentar o número) de um ou de alguns pedaços de DNA em várias ordens de magnitude, gerando milhões de cópias de uma sequência particular de DNA.

Utilizando um termociclador (aparelho que permite mudanças rápidas de temperatura), uma DNA polimerase, um par de iniciadores (primers) e dNTP´s (deoxinucleotídeos, que formarão a nova molécula de DNA) é possível sintetizar in vitro DNA a partir de uma fita molde.  Veja o vídeo no youtube.

Diz a lenda que Kary Mullis teve a idéia do PCR em um daqueles momentos de ócio produtivo enquanto surfava nas ondas do Sul da Califórnia. Um ano mais tarde, 1983, a sua idéia virou realidade através do desenvolvimento da primeira máquina de PCR. Dez anos mais tarde, 1993, Mullis também foi surfar após receber a notícia que havia sido ganhador do prêmio Nobel pela sua invenção. Essa é uma ótima desculpa para não trabalhar aos finais de semana no laboratório! (rs)

A partir do programa de PCR básico abaixo é possível desenhar um programa específico para seu iniciador e fragmento a ser amplificado. No passo (step) 2, ocorre a denaturação do DNA, No passo 3, ocorre a ligação do iniciador ao seu DNA, para isso é preciso calcular a temperatura de anelamento do seu iniciador. Existe um cálculo baseado na composição dos iniciadores (Ta = 2(A + T) + 4(C + G) – 5), mas existem alguns softwares que calculam para você (porém esta temperatura não deve ser abaixo de 50oC, para evitar ligações inespecíficas). Após a ligação dos iniciadores ao DNA, irá ocorrer a síntese de DNA pela DNA Polimerase, normalmente se utiliza a Taq polimerase que possui uma temperatura ideal de 72oC. O tempo de elongamento da sua sequência depende do tamanho dela, calcula-se cerca de 1 min para cada 1000 pares de base (não menos de 30 segundos). Finalmente, este ciclo será repetido 30 vezes.

Programa básico de PCR:

Step         Temperature (°C)      Time (min)

1                     95                                    2:00

2                     95                                    0:30

3                     55                                    0:30

4                    72                                      1:00

5                    Go to step 3,                    30 times

6                     4                                        forever

No próximo post vou comentar sobre o desenho de iniciadores (primers) e como montar uma reação de PCR!